Parasiten im Visier – Diagnostik von Nematoden
Verifizierung eines kommerziellen Western Blots zum Nachweis von Trichinella spp.-Antikörpern im Serum
Victoria Linz, Absolventin Bildungsgang BMA HF
Kontakt: heike.scheidhauer@edubs.ch
Ausgangslage
Im Diagnostikzentrum des Schweizerischen Tropen- und Public Health Instituts erfolgt der Nachweis von Trichinella-Antikörpern mittels der Methoden Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) und bei positiven oder unsicheren Ergebnissen ergänzend ein Immunofluorescence Antibody Test (IFAT)¹ zur Bestätigung. Die Resultate beider Methoden werden gemeinsam interpretiert.
¹Anm. der Redaktion: Da es sich hier um eine Facharbeit handelt, verzichten wir in dieser Zusammenfassung auf vollumfängliche Erklärungen von Fachbegriffen und Abkürzungen.
Ziel dieser Untersuchung
Bei genügend hoher Sensitivität und Spezifität könnte der kommerzielle Test Western Blots zum Nachweis von Trichinella spp.-Antikörpern im Serum die in-house Tests ersetzen, um die In-vitro-Diagnostika-Verordnung besser zu erfüllen. Die Verifizierung des Kits erfolgt hinsichtlich der Ergebnisse in Bezug auf Sensitivität, Spezifität, Kreuzreaktivität sowie Präzision und Richtigkeit.
Warum die Trichinellen-Antikörper Diagnose so wichtig ist
Die Trichinellose ist eine weltweit vorkommende parasitäre Zoonose, meist verursacht durch Trichinella spiralis. Die infektiösen Larven werden durch den Verzehr von rohem oder unzureichend gegartem Schweine- oder Wildfleisch übertragen. Die gesamte Entwicklung der Trichinellen findet im selben Wirt statt. Nach der Kopulation legt das Weibchen täglich ca. 1000-1500 Larven ab. Die Larven gelangen über das Blut-Lymphsystem in den Körper, wo sie in die quergestreifte Muskulatur eindringen und sich im Gewebe aufrollen. Die befallenen Muskelzellen bilden als Wirtsreaktion eine fibrotische Kapsel, in der die Larven vor dem Immunsystem geschützt sind.
Der Schweregrad der klinischen Symptomatik hängt von der Infektionsdosis (Anzahl aufgenommener Larven), der Häufigkeit des Verzehrs von infiziertem Fleisch, der Art und Zubereitung des Fleisches sowie der spezifischen Trichinenart ab. Ist die Inkubationszeit kürzer, so ist der zu erwartender Verlauf schwerer. Erste Symptome können Übelkeit, Fieber und Muskelschmerzen sein. In seltenen Fällen kann die Erkrankung zu schweren Komplikationen wie Myokarditis und Enzephalitis führen.
Abbildung 1: Trichinella spiralis in einer fibrotischen Kapsel
Die Methode – Western Blot
Für den Western Blot werden ES-Antigene von Trichinella spiralis mittel SDS-Polyacrylamid Gel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Der Rest der Membran wird mit Milchproteinen blockiert, die verhindern, dass Antikörper später unspezifisch an die Membran binden können. Mögliche im Serum vorhandene humane Anti-Trichinella Antikörper binden an die ES-Antigene von T.spiralis. Es entsteht ein Antigen-Antikörper-Komplex. Danach wird ein mit einer alkalischen Phosphatase markiertes Konjugat (Anti-Human-IgG) dazugegeben. Durch Zugabe des Substrats, das durch das Enzym alkalische Phosphatase umgesetzt wird, gibt es einen Farbumschlag. Die Reaktion wird gestoppt, indem das Substrat abgesaugt und mit destilliertem Wasser gewaschen wird. Sichtbar sind nun violette Banden an den Stellen, an denen Antikörper das passende Antigen gebunden haben. Ungebundene Antikörper oder Substrat werden durch gründliches Waschen zwischen den einzelnen Schritten entfernt. (Abb. 2)das passende Antigen gebunden haben. Ungebundene Antikörper oder Substrat werden durch gründliches Waschen zwischen den einzelnen Schritten entfernt. (Abb. 2)
Abbildung 2: WB-Streifen. 1: negative Kontrolle, 2: positive Kontrolle aus dem Kit, 3-4: Proben vom Referenzzentrum Berlin, 5: negative Blutspenderprobe, 6-7: Routineproben positiv in den Trichinella spp. ELISA/IFAT in-house Tests.
Ergebnis
Insgesamt wurden acht Ansätze gestartet. Bei jedem Ansatz wurde eine negative Kontrolle (Blutspenderserum) und die positive Kontrolle vom Kit mitgeführt. Die Ergebnisse der Streifen wurden nach dem 4-Augen-Prinzip bewertet. Alle positiven und negativen Kontrollen ergaben in allen Ansätzen korrekte Ergebnisse.
Die Spezifität betrug 100 %. Für die Darlegung der Kreuzreaktivität mit anderen Gewebshelminthen (Toxocara, Echinococcus, Fasciola, Filarien, Strongyloides, Schistosoma spp.) konnten keine Kreuzreaktionen detektiert werden. Die Präzision ergab ebenfalls ein Ergebnis von 100 %. Die Gesamtsensitivität betrug 60 %.
Fazit
Unklar ist, ob es sich bei der Gesamtsensitivität (60 %) bei den zuvor serologisch positiv getesteten Seren, die im Western Blot negativ sind, um falsch-positive ELISA/IFAT oder falsch-negative Western Blot-Ergebnisse handelt. Geplant ist, im Anschluss an die vorliegende Arbeit weitere positive Trichinella spp.-Seren – wenn möglich von klinisch bestätigten Patienten – auf dem Western Blot zu testen, um die Leistung des Tests weiter zu analysieren.